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香椿叶内生细菌分离方法的初探

（开题报告）

1 立题依据

1.1 项目研究的意义

香椿又叫香椿芽、香椿头、香椿尖，被称为“树上蔬菜”。 香椿叶厚芽嫩，绿叶红边，犹如玛瑙、翡翠，香味浓郁，营养丰富远高于其他蔬菜，为宴宾之名贵佳肴。民间食用香椿，据说从汉代起就开始了。香椿的吃法也很多，可炒食、腌制，也可作调味用，如小炒香椿芽、凉拌香椿芽、香椿芽拌冷面等等，都别有风味。此外，香椿中还富含维生素C、优质蛋白质和磷、铁等矿物质，是蔬菜中不可多得的珍品。

它不仅营养丰富，且具有较高的药用价值。中医认为，香椿味苦性寒，有清热解毒、健胃理气、杀虫固精等功效。

目前国内外尚未见有关香椿树内生细菌及其与生理活性物质关系的研究报道。为了能较全面客观的研究香椿树内生细菌多样性及获得更多的香椿树内生细菌资源。因此，本研究以香椿叶为研究材料，探讨香椿叶表面灭菌的佳条件，以及8种常用的细菌分离培养基对香椿叶内生细菌的分离效果。本研究结果可为选择合适的表面灭菌条件及培养基分离香椿叶内生细菌提供参考以及为进一步深入探讨研究抗香椿树病虫害的菌株质及为香椿树病虫害防治提供依据。

1.2 国内外研究现状分析

关于内生细菌的研究主要是集中在内生细菌的有益生物学作用，及内生细菌与寄主植物互作的生态学研究。植物内生细菌由于其与寄主植物具良好的亲合能力，可系统的分布于植物细胞间隙或细胞内，有足够的营养物质，并受到植物组织的保护，可避免外部恶劣环境的影响，相对于植物附生细菌更易发挥生防作用。因此，内生细菌的应用广泛受到人们的重视。

通过对内生菌的不断研究, 学者们在甘蔗的根、茎、叶内发现存在有大量的新型内生固氮菌重氮营养醋杆菌，这种内生菌具有严格的寄主专一性, 强的抗酸能力,能在高糖环境中生长和保持高效的固氮活性并与甘蔗建立联合固氮作用。此外，杨海莲等从水稻中分离出的内生细菌阴沟肠杆菌MR12(Enterobactercloacae)不仅具有固氮活性，而且对水稻稻瘟病和纹枯病具有较好的防治能力。

内生菌还能产生促植物生长物质，如植物生长素、赤霉素以及细胞激动素等，直接促进植物生长。张集慧等从兰科药用植物中分离出5种内生真菌，并从这些真菌发酵液和菌丝体中分别提取出5种植物激素，如赤霉素、阴哚乙酸、脱落酸、玉米素、玉米核苷等，它们对兰花的生长发育有较好的促进作用。郭顺星等对我国云南、四川等地采集的野生铁皮石斛和金钗石斛根中的内生真菌进行分离并测定其生物活性。测定结果表明，其中5种真菌可促进铁皮石斛种子萌发；3 种真菌可与铁皮石斛和金钗石斛幼苗形成共生关系并促进幼苗的生长。

目前，通过对一些药用植物的研究发现其某些内生菌可以产生与宿主植物相同或相似的药用成分，为药物生产开辟了新途径，为人类解决某些药用植物生长缓慢、资源紧缺等因素带来的药源紧张和生态破坏问题提供了新的思路。紫杉醇是由Wani等分离自短叶红豆杉的一种二萜类生物碱，具有独特的抑制微管解聚和稳定微管的作用,是目前从植物中发现的重要的抗癌药物之一，对卵巢癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、直肠癌等均有疗效。至今已从南方红豆杉、中国红豆杉、东北红豆衫、云南红豆杉等多种红豆杉属植物中分离到能够合成紫杉醇类化合物的内生菌。植物内生菌能产生多种抗生素，如肽、有机酸、萘等。Strobel G 等从雷公藤(Tripterygium wilfordii)的茎中分离到一株内生真菌，能产一种肽类抗生素，与棘白霉素和肺炎球菌素的化学性质相似，它不但能抑制灰葡萄孢(Botrytis cinerea)等一些植物病原真菌，对白色念毛霉及发癣菌也具有强烈抑制和杀灭作用，还能抑制白假丝酵母(Candida albicans)等人类病原真菌。在植物内生菌中转入抗病抗虫基因，将其作为外源基因载体是现在植物病虫害生物防治又一新思路。在植物中直接转入抗病虫基因没有在植物内生菌中转入抗病虫基因简单容易，被转入抗病虫基因的内生菌在宿主中表达，抗病虫物质直接分泌在植物体内，更易被运转。Snyman等人将Bt杀虫蛋白基因cry1Ac7导入甘蔗内生菌(Pseudomonas fluorescens)构建成工程菌并使其成功表达，对甘蔗害虫E. saccharina 表现出毒杀作用。

目前对于植物内生菌研究比较系统的有棉花、小麦和花生等。而对于香椿内生细菌的研究国内外鲜见报道。

2 研究方案

2.1 研究目标、研究内容和拟解决的问题

本实验从健康的香椿叶中分离内生细菌，旨在探讨香椿叶表面灭菌的佳条件，以及改良察氏琼脂培养基、淀粉铵盐培养基、TSA、BPA（肉汁胨培养基）、PDA、LB、KMB和NA 8种培养基对香椿叶内生细菌的分离效果以及优势菌株的分离。

本项目研究的内容为香椿叶佳表面灭菌条件的确定；不同培养基对内生细菌分离效果的比较；内生细菌的分离纯化及初步鉴定。

拟解决的关键问题是本研究利用细菌菌落表征性状和常规传统方法相结合，旨在利用多年生健康香椿叶为分离材料，分析香椿叶内生细菌种群多样性，探讨选择合适的表面灭菌条件和培养基分离香椿叶内生细菌，为香椿叶内生细菌的分离培养和进一步的研究奠定基础。

2.2 拟采取的研究方法及试验方案

2.2.1 香椿叶佳表面灭菌条件的确定

在河北经贸大学内采取一定量的健康香椿树的叶，称取1g表面清洗干净的香椿叶，然后依次用75%乙醇浸泡3min，次氯酸钠溶液（有效氯浓度分别为2%、2.5%、3%）分别浸泡2、3、4、5min。再用75%乙醇溶液浸泡30s，无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干。取后1次冲洗水200mL涂布于NA培养基平板上，同时用处理后的香椿叶于NA平板上轻压涂抹1次，设3个重复，同时以涂布200mL无菌水的NA平板为空白对照，28℃恒温培养4d，检测表面灭菌效果。

选取表面灭菌率为的条件进一步研究灭菌条件对香椿叶内生细菌分离数量和种类的影响。具体方法如下：将表面灭菌处理后的香椿叶置于经过无菌处理的搅拌机中并加入10mL无菌水，搅拌两到三分钟。绞碎后取匀浆液经梯度稀释后涂布于NA平板上，每个稀释度设3个重复，28℃恒温培养4d，观察并计菌落数，并计算单位重量的香椿叶在培养基平板上的菌落形成单位（cuf/g鲜重）。

2.2.2 稀释平板菌落计数法

稀释平板菌落计数法是一种常用的菌落计数法。取一定体积的稀释菌液与合适的固体培养基在其凝固前均匀混合，或涂布于已经凝固的固体培养基平板上。在适条件下培养后，从平板上出现的菌落数乘上菌液的稀释度，即可计算出原菌液的含菌数。在一个9cm直径的培养皿平板上，一般以出现50-500个菌落为宜。这种方法在操作时，有较高的技术要求。其中重要的是应使样品充分混匀，并让每支移液管只能接触一个稀释度的菌液。

计算公式：

每毫升样品中菌落形成单位（CFU）=同一稀释度3次重复的平均菌落数×稀释倍数×5

2.2.3 内生细菌的分离、纯化

将已经过佳表面灭菌条件处理的1g香椿叶置于无菌搅拌机中，按上述方法搅拌稀释后，取佳稀释度的匀浆液200mL分别涂布于上述8种培养基平板中，每个稀释度3个重复，28℃培养2d，计数。同时，根据菌落形态不同计数不同培养基所分离到的细菌种类数，并挑取优势菌株，纯化并保存。

在香椿叶中分离出的菌株中，根据菌落形态（大小、形状、颜色、表面光泽、湿度、透明度和质地等），分别挑取不同类型细菌，接种于上述8种琼脂培养基的平板上，置于28℃条件培养3d，经分离纯化后获得香椿叶的内生细菌，计算每个培养皿的菌落数，并且将内生细菌置于冰箱中保存以备进一步研究使用。

2.2.4 内生菌的初步鉴定

根据菌落的形状、大小、边缘特征、干湿、颜色、质地、表面光滑与否和透明度8个指标对菌落形态进行初步归类，采用直接挑取制片法观测所得的菌落在培养过程中的形态特征，对不同形态特征的菌落进行初步的统计鉴定。并分析8种不同培养基上优势菌株的情况。

2.3 本课题的创新之处

传统分离培养方法已经初步证实香椿叶内含有丰富的微生物，本研究采用细菌菌落表征性状鉴定的方法和常规传统方法相结合，旨在利用健康香椿叶为分离材料，分析内生细菌种群多样性，探讨分离培养香椿叶内生细菌的方法，为选择合适的培养基分离香椿叶内生细菌提供参考。

2.4 研究进度安排（请根据实际情况填写进度安排）

2013.09.01 ——2013.10.15   进行资料收集

2013.10.20 ——2013.11.15   开题报告

2013.11.20 ——2013.12.20   进行试验准备

2014.03.01 ——2014.04.30   进行试验

2014.05.01 ——2014.05.20   论文的撰写

2.5 预期研究成果

能够大限度地分离纯化出香椿叶内生细菌。探讨出香椿叶佳表面灭菌条件以及8种培养基对香椿叶内生细菌和优势菌株的分离效果。选择出合适的分离香椿叶内生细菌的培养基。

申请人：XX

2014年5月10日

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